不同多糖配伍对H₂O₂诱导的皮肤细胞老化的抑制作用研究

王冰心¹，钟铭¹，卢颖裕¹，高洁^1*，侯少贞¹，李世杰²（1广州中医药大学中药学院，广东省广州市 510006；2 广东省中药新药研发重点实验室，广东省广州市 510006）

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文题释义：

角质形成细胞（HaCaT）：是表皮中的主体细胞，从婴幼儿或者成人皮肤中原代分离培养人表皮角质形成细胞，经多种特征蛋白表达等鉴定后，即可传代备用。目前人皮肤永生化角质细胞HaCaT 细胞株已被广泛应用于化妆品的抗衰老及透皮性的研究中。

真皮中成纤维细胞(HSF)：它的活力会影响胶原蛋白的分泌、胶原蛋白纤维的数量和质量，成纤维细胞受损会导致胶原蛋白的降解与合成失调、胶原纤维构造紊乱，进而导致皮肤失去弹性并形成皱纹。皮肤的老化研究中，成纤维细胞体外培养技术已经成为研究皮肤老化的重要工具。

H₂O₂诱导皮肤老化：衰老自由基学说认为自由基累积导致的氧化损伤是皮肤衰老的重要原因^[1]。H₂O₂为活性氧家族中的一员，参与调节细胞信号转导和细胞的增殖、老化、凋亡、坏死等一系列生理病理过程。H₂O₂分子量小，可以跨膜扩散方式进入细胞内，是一种比较常用的细胞氧化应激剂和细胞老化诱导剂。

摘要   

目的：筛选出能够抑制H₂O₂诱导皮肤老化的不同多糖的最佳配伍。

方法：:通过国内外文献筛选几个抗氧化活性突出的中药或天然植物多糖，并由此组合成混合多糖，再通过实验进一步验证。利用不同浓度的H₂O₂诱表皮成纤维细胞（HSF)、角质形成细胞（HaCaT）出现损伤及老化，在此基础上，采用MTT法和SOD、MDA、HYP生化试剂盒，分别检测单一多糖和混合多糖对两种光老化表皮细胞生活率及SOD、MDA、HYP含量的影响。

结果与结论：与模型组相比，各组分单一多糖对H₂O₂致细胞老化模型的干预结果仅有个别生化指标改善程度显著；‚与模型组比较，相同浓度下的混合多糖的整体改善效果更为显著，其中，对HaCaT细胞生存率具有显著性差异(P<0.01)，SOD含量提高(P<0.01或P<0.05)，MDA含量下降(P<0.01)，HYP含量提高(P<0.05)；对HSF细胞生存率具有显著性差异(P<0.01)，SOD含量提高(P<0.01或P<0.05)，MDA含量下降(P<0.01或P<0.05)，HYP含量提高(P<0.01)。ƒ结果表明在对抗H₂O₂诱导的HSF、HaCaT老化实验中，在相同干预浓度下，几种不同多糖配伍后（石斛多糖+褐藻多糖+灵芝多糖+竹荪多糖）比其各组分单一多糖单独使用效果好。

关键词:

多糖；抗皮肤衰老；角质形成细胞；成纤维细胞；HYP

主题词：

多糖；抗皮肤衰老；角质形成细胞；成纤维细胞

基金资助：

1. 国家中医药管理局第四批全国中医优秀人才研修项目（国中医药人教发【2017】24号）

2. 广东省中药新药研发重点实验室（2017B030314096）

3. 广东省省级科技计划科技基础条件建设领域项目（2014A030304059）；

4. 广东省省级科技计划科技应用型科技研发专项资金项目（2015B020234008）

Inhibition of Different Polysaccharides on H₂O₂-induced Skin Cell Aging

Wang Bing-xin¹,  Zhong Ming¹, Lu Ying-yu¹, Gao Jie^1*,Hou Shao-zhen¹, Li Shi-jie² (1 School of  pharmaceutical Sciences ,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China; 2 Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and New Drug Research and Development, Guangzhou 510006, China;)

Abstract  

OBJECTIVE: To screen out the best compatibility of different polysaccharides that could inhibit skin aging induced by H₂O₂.

METHODS:  Several traditional Chinese medicines or natural plant polysaccharides with outstanding antioxidant activity were screened by domestic and foreign literatures, and thus combined into complex polysaccharides, which were further verified by experiments. Different concentrations of H₂O₂ were used to induce damage and aging of epidermal fibroblasts (HSF) and keratinocytes (HaCaT). On the basis of this,detecting the effects of single polysaccharide and complex polysaccharide on the survival rate and SOD, MDA and HYP content of two photoaged epidermal cells by using MTT assay and SOD, MDA, HYP biochemical kit .

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the intervention results of individual polysaccharides in the H₂O₂-induced cell aging model showed only a significant improvement in individual biochemical indicators. Compared with the model group, the overall improvement effect of the composite polysaccharide at the same concentration was more significant. Among them, the HaCaT cell survival rate was significantly different (P<0.01), SOD content increased (P<0.01 or P<0.05), MDA content decreased (P<0.01) and HYP content increased (P<0.05). The survival rate of HSF cells was significantly different (P<0.01), the content of SOD was increased (P<0.01 or P<0.05), the content of MDA was decreased (P<0.01 or P<0.05), and the content of HYP was increased (P<0.01).In summary, in the anti-H₂O₂-induced HSF and HaCaT aging experiments, the composite polysaccharide (Dendrobium polysaccharide + brown algae polysaccharide + Ganoderma lucidum polysaccharide + bamboo glutinous polysaccharide) has better effect than the single polysaccharide of each component at the same intervention concentration.

Subject headings:Polysaccharide; Anti-skin Aging; Keratinocytes; Fibroblasts

Funding: 

1.the Fourth Batch of National TCM Excellent Talents Training Program of the State Administration of Traditional Chinese Medicine , No.[2017]24;

2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and New Drug Research and Development,No.2017B030314096;

3.Science and Technology Plan Projects of Guangdong Province in China,No.2015B020234008;

4.Natural Science Foundation of Guangdong Province China,No.2014A030304059

0  引言  Introduction

衰老是生物体生命周期中的自然生命历程，细胞衰老是机体整体衰老的基础。对抗皮肤衰老，传统中药具有明显优势。而传统中药的生物活性多糖主要来源于植物、动物或微生物等天然生物，具有保湿、微血管美容、抗粉刺、美白、修复皮肤组织、调节机体免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗辐射、抗氧化和延缓衰老等多种美容功能 ^[2] -[4]。本实验目的在于筛选出具有显著延缓皮肤衰老功效的天然多糖，并验证其功效，为现有延衰护肤系列产品升级提供支撑。随着社会经济的不断进步和物质生活的丰富，护肤品不再是过去只有富人才用的起的东西，如今护肤品已走进了平常百姓家。所以通过科学研究，创新性地开发出一种以多糖为核心成分、以延衰为主要功效的皮肤护理产品^[5]。

通过系统分析国内外对中药/天然植物等多糖提取物的研究和应用情况，并筛选出4个代表性多糖，分别为褐藻、灵芝、石斛、竹荪多糖。考虑到不同多糖的活性特点有所不同，本研究拟在比较各单一多糖抗H₂O₂诱导的皮肤老化基础上，进一步对四个多糖混合成混合多糖的抗氧化活性进行评价。

1  材料与方法  Materials  and  methods

1.1设计   细胞学水平对比观察实验。

1.2时间和地点  于2017年9月在广州中医药大学中药学院开展

1.3实验材料

1.3.1.细胞  人永生化表皮成纤维细胞（HSF)、人永生化角质形成细胞（HaCaT），购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.3.2试剂  超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司，批号：20180105；微量丙二醛（MDA）测试盒，南京建成生物科技有限公司，生产批号：20180106；羟脯氨酸（HYP）测试盒，南京建成生物科技有限公司，生产批号：20180105；二甲基亚砜，广州瑞舒生物有限公司，生产批号：20170401 ；青霉素-链霉素双抗液，广州瑞舒生物有限公司，生产批号：1491907；胎牛血清，美国Gibco公司，生产批号：1507D；1640培养基培养基，美国Gibco公司生产批号：8117251；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，广州瑞舒生物有限公司，生产批号：20180501。

1.3.3供试品  本实验所用供试品，均由（广州中医药大学）广东省中药新药研发重点实验室制备。采用“水提醇沉”方法反复纯化各单一多糖，并采用苯酚-浓硫酸比色法测定各多糖样品中多糖的含量。以无水葡萄糖（C₆H₁₂O₆）计，各多糖的含量如下：褐藻多糖70%、灵芝多糖80%、铁皮石斛多糖92%、竹荪多糖86%。

1.3.4仪器  全波长酶标仪，1510 Thermo fisher scientific；光学显微镜 ECLIPSE CI，尼康仪器（上海）有限公司；超净工作台 YJ-VS-2，无锡一净净化设备有限公司；二氧化碳培养箱 MCO-20AIC，日本三洋公司。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养  细胞融合度达70~80 %时，用胰蛋白酶消化细胞，用含15%胎牛血清的DMEM培养液制成浓度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔加100µl的培养液即每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板中，将培养板移入孵育箱，在5% CO₂，37℃条件下培养。

1.4.2建立细胞过氧化模型   分别使用含250µmol/L^[6]和500 µmol/L^[7]H₂O₂ 的培养液处理HaCaT细胞和HSF细胞2小时，建立角质形成细胞过氧化模型和成纤维细胞过氧化模型。

1.4.3.1四种单一多糖

1.4.3.1.1配药    分别取褐藻、灵芝、石斛、竹荪多糖，用培养基溶解，配成质量为1g/L的药液，以孔径为0.22µm的微孔滤膜过滤除菌，再以培养基稀释成50µg/ml的浓度^[8]。注意现配现用。

1.4.3.1.2分组及给药  细胞种板培养24 h后，吸除培养细胞的培养基，分为对照组，过氧化模型组，过氧化+50µg/ml褐藻多糖组、过氧化+50µg/ml灵芝多糖、过氧化+50µg/ml石斛多糖、过氧化+50µg/ml竹荪多糖组，各组均具5个样本，按1.4.2的方法建立过氧化模型。

对照组：PBS洗3遍，不用H₂O₂处理，给予无药培养液培养24h。

模型组：分别使用含250 µmol/L和500 µmol/LH₂O₂的培养液处理HaCaT细胞和HSF细胞2小时，建立相应模型后PBS洗3遍，给予无药培养液培养24h。

各单一多糖给药组：造模后PBS洗3遍，分别使用50µg/ml的单一多糖培养液培养24h。

1.4.3.2不同配比的混合多糖

1.4.3.2.1配药  混合多糖A1、A2 、A3、A4、A5的组成分别按以下混合比例混合成质量为1g/L的药液，石斛多糖：褐藻多糖：灵芝多糖：竹荪多糖=（A1）1:1:1:1、（A2）2:1:1:1、（A3）1:2:1:1、（A4）1:1:2:1、（A5）1:1:1:2，以孔径为0.22µm的微孔滤膜过滤除菌，再以培养基配成50µg/ml的浓度。现配现用。

1.4.3.2.2分组及给药  细胞种板培养24 h后，吸除培养细胞的培养基，分为对照组，过氧化模型组，过氧化+50µg/mlA1、过氧化+50µg/mlA2、过氧化+50µg/mlA3、过氧化+50µg/mlA4，过氧化+50µg/mlA5,各组均具5个样本。

对照组：PBS洗3遍，不用H₂O₂处理，给予无药培养液培养24h。

模型组：含250 µmol/L和500 µmol/LH₂O₂的培养液处理HaCaT细胞和HSF细胞2小时，建立相应模型后PBS洗3遍，给予无药培养液培养24h。

各混合多糖给药组：造模后PBS洗3遍，分别使用50µg/ml的混合多糖A1、A2、A3、A4、A5培养液培养24h。

1.5主要观察指标

1.5.1检测HaCaT细胞和HSF细胞生存率  给药培养24h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20µl溶液，37℃继续培养4h，终止培养，，每孔加入150 µl DMSO，振荡10 min，而使结晶充分溶解。用全功能酶标仪，波长在490 nm处，测定各组的吸光值(A值)，以示细胞增殖情况。按照下列公式计算细胞存活率(%)=处理组的值/对照组的值×100 %。

1.5.2检测HaCaT细胞和HSF细胞SOD、MDA和HYP水平   给药培养24h后，收集每孔中的培养基上清液于离心管中，-20 ℃保存用以生化指标的检测。按照试剂盒说明书，检测细胞培养基上清液中的SOD、MDA和HYP含量。

1.6 数据处理

所有数据均用均值±标准差（）表示，采用SPSS17.0 软件对本研究的数据进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验。多组间差异比较用one-way ANOVA进行分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2  结果  Results

2.1单一多糖对H₂O₂老化HaCaT细胞存活率及生化指标的影响,结果见表1，用浓度为250µmol/L的H₂O₂处理HaCaT细胞，模型组的成活率达92%。在相同浓度下（50 µg/ml），各个多糖对改善HaCaT细胞的存活率大小顺序如下：竹荪多糖>石斛多糖>褐藻、灵芝多糖。H₂O₂致HaCaT老化模型组的SOD含量相较于正常组有显著性下降(P<0.05)，4种不同多糖在相同浓度下对H₂O₂导致的HaCaT老化模型培养上清液中SOD的含量相较于模型组有所提高，其提高的效果大致为：石斛多糖>灵芝、竹荪多糖>褐藻多糖。模型组MDA含量相较于正常组有显著性升高(P<0.01)，4种不同多糖在相同浓度下对H₂O₂导致的HaCaT细胞老化模型培养上清液中MDA的含量相较于模型组均有所下调效果不显著 。模型组HYP含量相较于正常组有显著性下降(P<0.01)，4种不同多糖在相同浓度下对H₂O₂导致的HaCaT细胞模型培养上清液中HYP的含量相较于模型组有所提高(P<0.01或P<0.05)，其提高的效果大致为：竹荪多糖＞石斛多糖＞褐藻多糖>灵芝多糖。

表1单一多糖对H₂O₂老化HaCaT细胞存活率及生化指标的影响（）

Table 1 Effect of Single Polysaccharide on Survival Rate and Biochemical Index of HaCaT Cells Induced by H₂O₂

表注：与空白组比较，^#P<0.05, ^##P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05, ^**P<0.01。

2.2单一多糖对H₂O₂诱导的HSF衰老模型的存活率及生化指标的影响，结果见表2，用500µmol/L的H₂O₂处理HSF细胞，模型组的成活率达62%。在相同浓度下（50 µg/ml），各个多糖对改善HSF细胞的存活率大小顺序如下：石斛多糖>灵芝多糖＞竹荪多糖>褐藻多糖。H₂O₂致HSF老化模型组的SOD含量相较于正常组有显著性下降(P<0.01)，4种不同多糖在相同浓度下对H₂O₂导致的HSF老化模型培养上清液中SOD的含量相较于模型组有所提高，其提高的效果大致为：灵芝多糖 >石斛多糖>褐藻多糖>竹荪多糖。模型组MDA含量相较于正常组有显著性升高(P<0.01)，4种不同多糖在相同浓度下对H₂O₂导致的HSF细胞老化模型培养上清液中MDA的含量相较于模型组均有所下调效果显著(P<0.01或P<0.05) ，其下调的结果大致为：石斛多糖＞褐藻多糖＞竹荪多糖>灵芝多糖。模型组HYP含量相较于正常组下降效果不显著。

表2单一多糖对H₂O₂老化HSF细胞存活率及生化指标的影响（）

Table 2 Effect of Single Polysaccharide on H₂O₂ Aging HSF Cell Survival Rate and Biochemical Index

表注：与空白组比较，^#P<0.05, ^##P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05, ^**P<0.01。

2.3混合多糖对H₂O₂老化HaCaT细胞存活率及生化指标的影响，结果见表3，与正常组比较，模型组过氧化HaCaT细胞存活率具有显著性下降(P<0.01)；混合多糖提高过氧化HaCaT细胞存活率的作用明显(P<0.01)。在相同剂量下（50 µg/ml），混合多糖A2提高过氧化HaCaT存活率略暂优势。与正常组比较，模型组（过氧化的HaCaT细胞）的SOD和HYP显著下降、MDA显著升高(P<0.01)；与模型组比较，对于不同配伍比例的混合多糖，均能不同程度提高H₂O₂致老化HaCaT细胞SOD和HYP的水平和抑制MDA的生成（P<0.01或P<0.05）；其中混合多糖A2组整体效果更佳。

表3混合多糖对H₂O₂老化HaCaT细胞存活率及生化指标的影响（）

Table 3 Effect of Compound Polysaccharide on Survival Rate and Biochemical Index of H₂O₂ Aging HaCaT Cells

表注：与空白组比较，^#P<0.05, ^##P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05, ^**P<0.01。

2.4混合多糖对H₂O₂老化HSF细胞存活率及生化指标的影响，结果见表4,，与正常组比较，模型组过氧化HSF细胞存活率具有显著性下降(P<0.01)；混合多糖提高过氧化HSF细胞存活率的作用明显(P<0.01)。在相同剂量下（50 µg/ml），混合多糖各组在提高过氧化HSF细胞存活率基本相近。与正常组比较，模型组（过氧化HSF细胞）的SOD和HYP显著下降、MDA显著升高(P<0.01)；与模型组比较，对于不同配伍比例的混合多糖，均能不同程度提高H₂O₂老化的HSF细胞SOD和HYP的水平和抑制MDA的生成（P<0.01或P<0.05）；其中混合多糖A5组整体效果更佳。

表4混合多糖对H₂O₂老化HSF细胞存活率及生化指标的影响（）

Table 4 Effect of Compound Polysaccharide on H2O2 Aging HSF Cell Survival Rate and Biochemical Index

组别	细胞存活率 （%）	SOD（(U/mg）	MDA（(μmol/g）	HYP（μmol/g）
空白组	100±6.02	9.83±0.18	2.82±0.44	备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《广东电力》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复