JUND蛋白在乳腺癌中的表达及意义

代新珍 米贤军 钟守军 段立锋 杨伟洪 刘祥玉 徐秀梅 陈昂 陈志强 黄兆华

【基金项目】卫生部局立项、省卫生厅资助项目(2017J112)

【摘  要】 目的  分析 JUND蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测JUND在112例浸润性乳腺癌及20例乳腺癌旁正常组织中的表达情况。结果  ①JUND在乳腺癌中的表达明显低于乳腺癌旁正常组织（Ｐ＜0.05）。② JUND蛋白在乳腺癌中的高表达率与低组织学分级、无淋巴结转移、ER阴性及KI67高表达相关（Ｐ＜0.05），与肿物直径大小、PR、HER2的表达及年龄无关（Ｐ＞0.05）。结论  JUND在乳腺癌中的表达与组织学分级、淋巴结转移、ER阴性、Ki67的表达相关，检测乳腺癌中JUND的表达水平可以作为乳腺癌发生、发展的评价指标。

【关键词】 乳腺癌； 免疫组织化学； JUND

Expression and clinical significance of JUND in breast carcinoma

Dai Xinzhen Mi xianjun Zhong shoujun Duan lifeng Yang weihong Liu xiangyu Xu xiumei Cheng ang Cheng zhiqiang Huang zhaohua

(The Affiliated Zhongshan Boai Hospital of Southern Medical University, Zhongshan 528403)

Abstract： Objective  To investigate the expression of JUND in breast carcinoma and its clinical significance．Methods  Clinical pathological data of 112 patients with breast carcinoma were collected and immunohistochemical examination was performed for breast carcinoma and 20 patients with normal breast tissue．Results  ①The expression of JUND in breast carcinoma was lower than that in normal breast tissue（Ｐ＜0.05）.② Based on immunohistochemical staining，High positive expression rate of JUND was associated with clinicopathological characteristics such as axillary lymph nodes negative,low histological grade and ER negative,Ki67 positive（Ｐ＜0.05）．There is no correlation between JUND and tumor diameter,age,PR,HER2（Ｐ＞0.05）.Conclusion JUND expression was associated with axillary lymph nodes negative,low histological grade and ER negative and Ki67 positive.To study the expression of JUND in breast carcinoma may provide an evaluation index of the development and progression of breast cancer.

【Key words】 breast cance; immunohistochemical examinationr;JUND

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率有上升并有年轻化的趋势，占女性肿瘤死亡原因的第二位。目前研究发现乳腺癌的发生、发展是一个极为复杂的过程, 其中癌基因的活化、抑癌基因缺乏起主导作用。近年来随着对AP- 1 家族成员研究的不断深入，发现其参与肿瘤的形成、侵袭和转移等生物学过程, 而JUND作为AP- 1 家族成员中重要的一员，很多研究预测并提示JUND基因参与肿瘤的增殖、分化与凋亡，并在乳腺癌的发生发展中充当重要角色^[1-2] 。然而目前国内外对于通过免疫组化SP法检测JUND在乳腺癌组织中的表达及具体作用研究鲜有报道。本研究应用免疫组织化学方法（SP法）检测 JUND蛋白在浸润性乳腺癌及乳腺癌旁正常组织中的表达，分析其表达和乳腺癌病理、临床特征的关系，为乳腺癌临床治疗与预后评价提供新的依据。

1　材料与方法

1.1　资料：随机抽取且经我科3位病理医生证实的112例女性乳腺癌患者标本，20例癌旁正常乳腺组织（正常组织取自浸润性乳腺癌旁正常乳腺组织）作为对照。患者２8～80岁，中位年龄4１岁。乳腺癌患者中术后淋巴结未转移者69例，淋巴结转移者43例；乳腺癌患者中术后标本肿物直径≤２ｃｍ 的61例，肿物直径＞2ｃｍ 的51例。共112例标本，所有乳腺癌患者均是首次住院行肿块切除术，未做放疗、化疗及内分泌治疗，也未进行腋窝淋巴结活检手术以及腋窝的其他手术，均行乳腺癌改良根治术或乳腺肿物切除术,术前临床资料完整。

1.2　试剂

兔单克隆抗体JUND购自abcam及SP试剂盒购自罗氏公司。

1.3　免疫组化SP法

   JUND抗体工作浓度为1∶300。用PBS液代替第一抗体作阴性对照。主要步骤: 采用免疫组织化学SP法染色,按说明书操作。以pH 6.0的拘缘酸盐缓冲液微波修复抗原,滴加1∶300 JUND单克隆抗体80ul,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,试剂盒赠送的阳性片作为阳性对照,4℃过夜孵育；PBS洗后，滴加过氧化酶标记的二抗，37℃孵育45min；PBS洗后，DBA显色；苏木素复染、脱水、透明、中性树脂封片。

1.4　阳性结果判断

ER、PR、HER2判定根据《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》^[3]；ER、PR、Ki67定位于细胞核，HER2定位于细胞膜；Ki67结果根据棕褐色染色细胞数>15％为阳性；ER、PR结果根据棕褐色染色细胞数>1％为阳性；HER2浸润性肿瘤细胞无胞膜着色或≤10％的浸润性肿瘤细胞呈现不完整的、微弱的胞膜着色为(0)；>10％的浸润性肿瘤细胞呈现不完整的、微弱的胞膜着色为(1+)；>10％的浸润性肿瘤细胞呈现不完整和／或弱至中等强度的细胞膜棕黄着色或≤10％的浸润性肿瘤细胞呈强且完整的细胞膜着色均为(2+)；>10％的浸润性肿瘤细胞呈现强且完整的细胞膜着色为(3+)；以上标准均随机选5个高倍视野(×400)进行计数。JUND以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞信号。判断方法为在镜下观察, 根据棕色反应的阳性强度及面积判断结果。采用二级积分法：阳性细胞数≤５％为０分，６％～２５％为１分，２６％～５０％为２分，５１％～７５％为３分，≥７５％为４分；染色强度淡黄色为１分，黄或棕黄色为２分，棕黄色为３分；两者得分相乘≥12分为（ ＋ ）。阅片采用双盲法读片。

1. 5　统计学处理

全部统计分析用SPSS 19.0完成。本实验计量资料用x ± s 描述，两组样本间卡方检验，P ＜ 0．05 差异有统计学意义。

２结 果

２．１  JUND的表达：JUND在乳腺组织的表达方式为无表达或棕褐色弥漫一致强阳性表达两种形式。112例浸润性乳腺癌组织中 JUND阳性表达率为42.8％（48／112），20例乳腺癌旁正常组织中 JUND 阳性表达率为100％（20／20）。JUND在浸润性导管癌的表达明显低于乳腺癌旁正常癌组织中的表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表１。

２．２ JUND的表达与乳腺癌临床病理特征的关系：JUND蛋白在乳腺癌中的高表达率与低组织学分级、无淋巴结转移、ER阴性、Ki67高表达相关（P＜0.05），与肿物直径大小、PR、HER2的表达及年龄无关（P＞0.05）。见表１。

表１ JUND蛋白在乳腺癌组织中的表达情况及与临床病理指标的关系

项目             例数    JUND阳性  阳性％   χ²值     P值

病理学类型浸润性导管癌  112      48      42.8     22.185    0.000

          正常组织      20       20       100

淋巴结   无转移     66       34       51.5    4.539     0.033

有转移     45       14       31.1

肿瘤大小直径≤２ｃｍ    59       23       38.9     0.764    0.382

       直径＞2ｃｍ  53       25       47.1

组织学分级Ⅰ级         12       10       83.3      8.991   0.003

Ⅱ级-Ⅲ级     100      38       38.0

雌激素受体阴性         26       15       57.7      3.865   0.049

阳性         86       31       36.0  

孕激素受体阴性         35       13       37.1      0.679   0.410

阳性         77       35       45.5

Her2      0-++          88       39       44.3      0.358   0.550

          +++           24       9        37.5

Ki67      阴性          69       24       34.8      4.785   0.029

          阳性          43       24       55.8

３ 讨 论

乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，其预后与肿瘤大小、组织学分级、ＥＲ 受体、ＰＲ受体、ki67、ＨＥＲ－２受体等多种因素相关。随着分子生物学领域的发展，越来越多的生物标志物被发现，为其预后判断、治疗方案的选择提供了更全面的依据。

JunD 蛋白是由 JunD 基因编码，由 347 个氨基酸组成的分子量约为 35 kD 的 AP-1 转录因子。JUND^［4］作为AP- 1 家族成员中重要的一员，JUND参与肿瘤的增殖、凋亡及分化，在肿瘤的形成过程中起着重要作用。国外研究发现在 T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤及恶性胶质瘤的癌细胞中，JunD的蛋白和mRNA都呈现出常表达异常 ^［5-7］。Aurore Toullec^［8］等研究发现JUND的表达缺失激活了肿瘤反应基质，促进乳腺癌的发生，并且JUND的表达缺失降低了乳腺癌患者的无瘤生存率。本研究中浸润性乳腺癌中JUND的阳性表达率为 42.8％，明显低于于乳腺正常组织的阳性表达率10０％（P＜0.01），JUND表达缺失促进肿瘤的发生，研究结果与Aurore Toullec是一致的。JUND蛋白协调细胞正常增殖、分化及转化等过程,下调 JunD 会影响细胞的成熟和分化，促进细胞增殖^［9］。本研究通过免疫组化检测112例浸润性乳腺组织中JUND的表达，发现JUND蛋白在乳腺癌患者无腋窝淋巴结转移组的表达率明显高于转移组；在组织学Ⅰ级（高分化）中的表达率明显高于组织学Ⅱ级及Ⅲ级组（中-低分化）；表明了JUND的表达与肿瘤恶性程度有关，随着恶性等级增高，其阳性率逐渐降低。JUND 高表达的乳腺癌细胞分化往往较好，无腋窝淋巴结转移，与上述文献预测一致。乳腺癌是激素依赖型肿瘤，ＥＲ、ＰＲ 是目前认可的预测对内分泌治疗最可靠的生物标志物， 因此研究乳腺癌组织中JUND的表达与ＥＲ、ＰＲ 的关系极为重要。本研究发现JUND蛋白在乳腺癌中ER阴性组的表达率高于ER阳性组，结果与Chen D^［10］等结果一致即在人类乳腺癌细胞中，JunD 蛋白与JunB蛋白协同作用，选择性降低芳香化酶的活性，抑制雌激素的合成，在乳腺癌中JUND高表达ER部分表达缺失。本研究结果还发现JUND的表达与PR、HER2的表达无明显相关性，因此检测JUND在乳腺癌中的表达对内分泌治疗预测目前暂不明朗，有待后期进一步研究。

   JUND在乳腺癌细胞增殖的作用国外研究目前尚存在争议，在体外环境中，Caffarel MM^［11］等预测JUND抑制乳腺癌细胞的增殖，而Travis B. Salisbury^［12］等发现JUND能够通过正相调节CCND1的表达进而促进乳腺癌细胞的增殖。本研究结果显示JUND在乳腺癌的表达与Ki67正相关，JUND促进乳腺癌细胞的增殖，此现象很难解释JUND在乳腺癌中维持正常分化，抑制乳腺癌转移，预后较好现象；可能存在以下原因：①JUND的表达与组织学分级相关，在组织学1级即分化较好的乳腺癌组织中，JUND高表达延长了细胞生存时间，抑制频繁的细胞分裂增殖的过程中，细胞基因组发生多种改变。②乳腺癌的发生是多基因综合作用的结果，JUND参与多种基因的转录前后调控，在人类复杂基因环境中会受多种因素的影响，故JUND在增殖能力强即Ki67高表达组的乳腺癌中的高表达可能与某些基因在肿瘤进展到一定程度促增殖作用强于JUND相关，抑或是JUND的高表达促进了肿瘤发展过程中其他促增殖基因的表达。肿瘤的发生发展是多因素、多步骤综合作用的结果，要确切JUND在乳腺癌预后中的意义还有进一步待于深入研究其在乳腺癌增殖过程中的确切作用机制及调节机制。

综上所述，在乳腺癌中，JUND在乳腺癌中的阳性表达率为42.8%，与组织学分级、腋窝淋巴结转移呈负相关，在乳腺癌中起着维持正常分化，抑制淋巴结转移等作用，是预后较好的指标，检测JUND在乳腺癌中的表达有助于个体化判断乳腺癌患者的预后并为指导治疗提供新的研究方向。

参 考 文 献

［1］Gene 

Expression Changes in the Pituitary Gland of Rats Exposed to Electromagnetic Pulses［J］．QI YuHong ,LIANG Jun,HUI YanPing al．Biomed Environ Sci,2011(5).

［2］The Regulatory Mechanism of the LY6K Gene Expression in Human Breast Cancer Cells［J］．Hyun Kyung Kong, Sukjoon Yoon, Jong Hoon Park.BIOLOGICAL CHEMISTRY，2012(46).

[3]乳腺癌HER2检测指南(2014版)编写组.乳腺癌HER2检测指南(2014版)[J]中华病理学杂志,2014(4).

［4］Chemopreventive agents alters global gene expression pattern: predicting their mode of action and targets［J］.Narayanan BA.Curr Cancer Drug Targets. 2006(8).

［5］A genomic and expression study of AP-1 in primary cutaneous T-cell lymphoma: evidence for dysregulated expression of JUNB and JUND in MF and SS［J］．Mao X，Orchard G，Mitchell T J，et al．J Cutan Pathol.2008(10).

［6］Abnormal AP-1 protein expression in primary cutaneous B-cell lymphomas［J］．Mao X，Orchard G．Br J Dermatol.2008 (1).

［7］Epidermal growth factor receptor and PTEN modulate tissue factor expression in glioblastoma through JunD / activator protein-1 transcriptional activity［J］．Rong Y，Belozerov V E，Tucker-Burden C，et al．Cancer Res.2009( 6).

［8］Oxidative stress promotes myofibroblast differentiation and tumour spreading［J］．Aurore Toullec, Damien Gerald1y , Gilles Despouy al.EMBO Molecular Medicine. 2010（10）.

［9］JunD 的结构功能特征及其在肿瘤发展中的作用［J］．刘英，王岛，伍会健.中国生物化学与分子生物学报.2012（7）.

［10］JunD and JunB integrate

prostaglandin E2 activation of breast cancer- associated proximal aromatase promoters［J］．Chen D，Reierstad S，Fang F，et al．Mol Endocrinol.2011 ( 5 ).

［11］JunD is involved in the antiproliferative effect of Delta9-tetrahydrocannabinol on human breast cancer cells［J］．Caffarel MM1, Moreno-Bueno G, Cerutti C，et al．Oncogene.2008(37).

［12］Aryl Hydrocarbon Receptor Ligands Inhibit IGF-II and

Adipokine Stimulated Breast Cancer Cell Proliferation［J］．Travis B.Salisbury,Gary Z.Morris,Justin K.Tomblin，et al．ISRN Endocrinology.2013(10).