ARTN在食管鳞状细胞癌中的表达及临床病理联系

陈雅琪，蹇顺海，黄一凡，文  彬

（川北医学院病理教研室/川北医学院附属医院病理科，四川 南充 637000）

摘要：目的 研究ARTN在食管鳞状细胞癌组织中的表达及与食管鳞癌患者临床病理特征及预后的联系。方法 采用免疫组化SP两步法检测ARTN蛋白在114例食管鳞状细胞癌组织、17例高级别上皮内瘤变组织、25例正常食管组织中的表达； Western blot法检测ARTN在12例新鲜食管鳞癌组织及配对的癌旁组织中的表达，分析ARTN表达与患者临床病理及预后的关系。结果 免疫组化：ARTN在食管正常组织、高级别上皮内瘤变组织、食管鳞癌组织中的阳性表达率分别为0% (0/25)，23.5% (6/17)，80.7% (92/114);Western blot：食管鳞癌组织中ARTN的表达高于癌旁正常组织；ARTN表达与癌浸润深度、TNM分期及预后相关（P<0.01）。结论  ARTN促进食管鳞癌进展，可能成为判断患者浸润深度、临床分期及预后的指标。

关键词：食管鳞状细胞癌；浸润深度；临床分期；预后；ARTN；免疫组化；Western blot

中图分类号：R 735.1   文献标志码：A  

The expression and clinicopathologic relationship between ARTN and esophagus squamous cell carcinoma

CHEN Ya-qi,JIAN Shun-hai,HUANG Yi-fan,WEN Bin

（Department of Pathology, North Sichuan Medical College/ Department of pathology, affiliated hospital of north sichuan medical college ,Nanchong 637000, China）

ABSTRACT Purpose To investgate the expression and clinical and prognostic significance of ARTN in esophagus squamous cell carcinoma(ESCC). Methods 114 cases of esophagus squamous cell carcinoma,17cases of high grade intraepithelial neoplasia and 25 cases of nomal esophageal tissue were selected to determine the expression of ARTN by immunohistochemistry;12 cases of fresh tissues and paired nomal tissues were selected to determine the expression of ARTN by Western-blot. Results The percentage of positive expression of ARTN in nomal esophageal tissue, high grade intraepithelial tissue and ESCC were 0, 23.5%, 80.7% respectively by immunohistochemistry, and the expression of ARTN in ESCC was higher than adjacent tissues by Western blot. moreover, the expression of ARTN was associated with deeper invasion, higher clinical stage and poor survival outcome of patients with ESCC. Conclusion The expression of  ARTN accelerate disease progression and it maybe a useful clinical and pathological predictor for ESCC.

Key words: esophagus squamous cell carcinoma;Invasion;clinical stage;prognosis;ARTN; immunohistochemistry; Western blot

食管癌是消化道常见恶性肿瘤，我国是食管癌的高发地区，高发区发病率约121/1万，是世界低发病率病率地区的20倍以上，每年新发病例27万以上，其中超过20万的患者死亡，死亡率居第四位^[1-2]，食管癌早期症状不明显，发现时已经是中晚期，患者预后差，若能早期发现食管癌，能极大减轻患者痛苦，提高生存率。ARTN是胶质细胞源神经营养因子家族成员之一的蛋白编码基因，ARTN与下游的GFRα3及RET形成复合物，激活SMAD家族转录因子，调节基因表达^[3-4]。研究发现，ARTN蛋白在多种恶性肿瘤中表达，并发挥一定生物学作用，但ARTN与食管鳞状细胞癌的关系上不明确。本实验通过检测ARTN在食管鳞癌中的表达，来探讨ARTN与食管鳞状细胞癌临床病理参数及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 样本来源

1.1.1 免疫组化标本 收集2009年1月1日～2010年9月30日川北医学院附属医院存档确诊的食管鳞状细胞癌包埋石蜡样本本114例，患者年龄39～82岁，高级别上皮内瘤变样本17例，年龄42～75岁，食管正常组织25例（以无肿瘤的切缘替代）作对照，年龄49～78岁。所有标本术前均未经放化疗，签署相关知情同意书，符合医学伦理学规定。

1.1.2 Western blot标本  选取2014年3月～2014年6月期间川北医学院附属医院心胸外科手术切除的新鲜食管肿瘤组织及配对的距肿瘤大于5 cm的正常组织12例，年龄42～72岁，其中男性9例，女性3例，术后均确诊为食管鳞状细胞癌；切除后置于冰上，生理盐水冲洗后以100mg每份分装于冷冻管，置于冷冻盒中于-80 ℃冰箱保存。所选样本来源的患者术前均未经放化疗，并签署知情同意书。

1.2 免疫组化  ARTN兔抗人多克隆抗体购自Abcom公司（稀释浓度1∶50），所选蜡块冷冻后每个切白片3 μm厚，以胰腺癌标本做阳性对照，组织本身做阴性内对照，采用SP两步法检测ARTN蛋白的表达。ARTN阳性信号呈棕黄色颗粒，表达于鳞状上皮细胞膜或者细胞质。结果判读由ARTN阳性染色范围及着色强度共同确定评分。阳性染色范围以阳性细胞所占百分比划分，无细胞着色判为0分；<25%为1分；25%～50%为2分；50%～75%为3分；>75%为4分。着色强度无色为0分；着色浅黄为1分；棕黄为2分；棕褐为3分。总分将两者分数相加，由两位副高及以上级别病理医师共同打分，最后取平均分，≤2分为阴性（﹣），3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。

1.3 Western blot检测  蛋白提取，BCA蛋白浓度测定，凝胶配置试剂盒、上样缓冲液、电泳液、转膜液、PVDF膜、超敏ECL发光液购于碧云天公司。操作按试剂盒说明进行，取食管鳞癌组织，癌旁组织各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混匀，冰上裂解，低温离心，取上清液分装，上清液按4∶1加电泳缓冲液于PCR仪上99 ℃变性15 min，与配置好的凝胶上样电泳，浓缩胶80 V至分离胶时，改为120 V电泳至分离胶底部，剪裁与胶相适大小PVDF 膜，甲醇中活化15 s，转膜，5%脱脂奶粉封闭3 h；4 ℃冰箱内一抗（ARTN浓度1∶3000，GAPDH浓度1∶2 000）过夜，次日常温二抗（1∶5 000）60 min，ECL发光，图像采集。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间对比采用χ²检验，计量资料用`x±s表示，组间计量资料比较用配对t检验，生存分析采用Kaplan-Meier曲线，用对数秩检验图表示。

2 结果

2.1 不同食管组织中ARTN蛋白的表达  ARTN蛋白主要定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄或棕褐色。ARTN蛋白在正常食管黏膜上皮中不表达，在高级别上皮内瘤变组织和食管鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为23.5%，80.7%。癌组织阳性表达率明显高于高级别上皮内瘤变及正常食管黏膜上皮。差异有统计学意义（P＜0.01，）。具体情况见图1、表1。

图1  ARTN在食管鳞状细胞癌组织中的表达  （SP两步法）

表1 不同食管组织中ARTN表达情况

       N为正常组织，H为高级别上皮内瘤变组织，ESCC为食管鳞状细胞癌组织；^△与H比较，P＜0.05；^○与ESCC比较，P＜0.01；^◇与N比较，P＜0.01

2.2 食管鳞状细胞癌中ARTN蛋白表达与临床病理特征的关系  114例食管鳞状细胞癌中，男性89例，女性25例；年龄39到82岁，中位年龄57岁。统计ARTN蛋白与患者病例参数之间的关系，ARTN表达与浸润深度，TNM分期有关（P＜0.05）；与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移无关，差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2  ARTN蛋白的表达与食管鳞状细胞癌病理特征的关系

2.3  Western检测ARTN蛋白在新鲜食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达 手术室搜集新鲜标本，术后病理均确诊为食管鳞状细胞癌组织12例，搜集配对的癌旁组织（与癌组织距离﹥5cm）。Western blot检测以分子量36 KD的GAPDH作内参，相对表达量以ARTN与GAPDH灰度值比值表示，观察ARTN蛋白的表达情况。结果发现ARTN蛋白在食管鳞癌组织和正常组织中均有不同程度的表达，但在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 生存分析  为评价ARTN的表达与食管鳞癌患者预后的关系，本次实验通过电话对患者进行回访，以手术出院之日起，至满5年止，共获得39例资料。其中18例存活，总生存率46.2%。ARTN阳性表达的30例，11例存活,五年生存率为36.7%（11/30）。阴性表达占9例，7例存活，5年生存率77.8%（7/9），ARTN阳性表达组五年生存率明显低于阴性表达组，差别具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

3 讨论

   食管癌是消化道常见的恶性肿瘤，世界各地由于癌症引起患者死亡的原因中,食管癌居第六位,每年新增病例超过48万例^[5],食管癌组织学分类分为食管鳞状细胞癌（esophagus squamous cell carcinoma，ESCC